Observación: en el estudio siempre se han utilizado las mismas muestras, macetas o alveolos, las cuales se extraían completamente de su contenedor, y se tomaba muestra hacia la mitad de la maceta (10 g) tanto para extraer raíces, esporas o propágulos, y tras este proceso, se volvían a meter en su contenedor.

La micorrización se ha evaluado atendiendo a tres parámetros: densidad de raíces, colonización de raíces y producción de esporas/propágulos.

TINCIÓN DE RAÍCES MICORRIZADAS

Se pesan 1 g de raíces extraídas del suelo o de la planta (las más finas) y se lavan durante dos minutos con agua abundante, (comprobaremos por rutina que el pH se encuentra entre 7 y 8 y el nivel de cloro que se encuentre entre 0,2 a 0,8 ppm), luego se colocaron en vasos de cultivo in vitro de 250 ml. Se clarifican hidróxido de potasio (KOH) al 10% hasta que todas las raíces quedaron cubiertas y se mantuvieron en baño maría a 90 °C durante una hora (dependiendo del tamaño de la raíz puede ser más o menos). Posteriormente, se elimina el hidróxido de potasio (KOH), se lava con agua y se añade ácido clorhídrico (HCI) al 2% durante una hora a temperatura ambiente. Luego se elimina el HCl y se lavan las raíces con agua.

Finalmente, se aplica la tinción con tinta azul Pelikan como colorante acidificada con acético y se deja al baño maría a 90 °C durante una hora; transcurrido este tiempo se decanta el tinte y las raíces se depositan en placas de Petri con glicerol. Las placas se conservan refrigeradas hasta el día de la evaluación.

DETERMINACIÓN EL NIVEL DE COLONIZACIÓN

Se toman varias muestras pequeñas de la masa de raíces al azar. La masa total de esta muestra debe ser de 0,1 a 0,2 g. Se tiñe la muestra según la técnica anterior. Las raíces se disponen aleatoriamente en una placa de contacto de 6 cm de diámetro con filtro de microfibra cuadriculado (Cuadrícula de 0,5 cm2).

Se observan las raíces bajo el microscopio estereoscópico, tomando los siguientes datos bajo lupa binocular a 20-40X:

·  No total de intersecciones entre líneas de la cuadrícula y las raíces (R1).

·  No total de intersecciones donde la raíz está micorrizada (R2)

Calculamos el porcentaje de micorrización observando el número de intersecciones raíz micorrizada respecto al total de intersecciones de las raíces (R1*100/R2).

MONTAJE DE PREPARACIONES Y OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Tomamos varios trozos de raíces conservadas en glicerol con unas pinzas de puntas muy finas y los colocamos sobre un porta-objetos. Echamos unas gotas de agua o bien de PVLG en un lado y colocamos un cubre-objetos de tal forma que el extremo del cubre-objetos cubra el agua o el PVLG.

Inclinamos la preparación con ayuda de un lapicero para que todo el líquido se extienda por toda la preparación. Evitar, en lo posible, que se formen burbujas. Es conveniente realizarlo bajo el microscopio estereoscópico.

Posteriormente realizamos la observación con el microscopio óptico a 40, 100 o 400 aumentos.

EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE ESPORAS Y PROPÁGULOS, RECUENTO

Se pesan 5 g de suelo fresco y se colocan en bote de cultivo in vitro con agua (a pH entre 7 y 8 y Cloro libre 0,2-0,8 ppm), se rompen los agregados con una espátula. Se añade agua hasta 200 ml de agua destilada y la suspensión se agita durante 1h a 200 rpm en agitador orbital. La suspensión se pasa por tamices de 500 m, 250 m (A) y 50 m (C). Se añade agua para limpiar bien el bote. Los materiales retenidos en los tamices A y C se colocan en dos tubos centrífuga con 50 ml de agua. Se centrifugan durante 5 minutos a 2000 rpm. Se descarta el sobrenadante de cada tubo. El sedimento se resuspende en sacarosa al 50% y se centrifuga a 2000 rpm 2 min. El sobrenadante se pasa por un papel de filtro Prat Dumas y se lava dos veces con agua destilada, usando vacío con equipo de filtración con embudo Büchner y placa porosa. Los papeles se colocan en placa Petri y se mantienen en refrigeración hasta su identificación y conteo. Bajo el estereoscopio y el objetivo de 2, aislamos esporas y se cuentan.

CÁLCULO DE LA DENSIDAD DE RAÍCES

Para el cálculo de densidad de raíces a lo largo del tiempo, se tomaba muestra del cepellón hacia mitad del contenedor, ayudados de unas tijeras. Se pesan 10 gramos de suelo (M1) y se aíslan las raíces y se pesan (M2). Se calcula la masa de raíces respecto a la masa total de suelo extraída.

DESARROLLO DE CULTIVOS TRAMPA PARA GENERAR INÓCULO

· Búsqueda de inóculos, comprobación de los mismos

Se buscan lugares cercanos a las finca de trabajo que presuponemos que no han sido cultivados, o tratados desde un mínimo de 5 años. Para ello se eligen tres puntos: en monte en un bosque de repoblación de unos 15 años, un pastizal y un linde de huerta que se encuentra en ecológico.

Se toman muestras con pala hasta unos 20-25 cm, se eliminan la vegetación superior y se introducen en bolsas. Se transportan al laboratorio donde son desmenuzadas y se comprueba si hay raíces, esporas o propágulos según las técnicas anteriores.

· Desarrollo de cultivos trampa

A las muestras anteriores desmenuzadas se les cortan las raíces en fragmentos pequeños y se mezclan completamente con el suelo asociado usando una tijera. A este inóculo puro (mezcla de las raíces y suelos original) se añade arena gruesa autoclavada, vemiculita y compost en relación 1:1

(v/v). Usamos bolsas con cierre (Zip-loc) para el proceso de mezcla, porque es más fácil de “masajear” la bolsa y romper los pequeños grumos de suelo o raíces y mejorar las probabilidades para obtener un producto homogéneo.

Esta mezcla se transfiere a un blíster con 35 alveolos, se usa un blíster para cada tipo de inóculo (monte, pradera y huerta). Se siembran en 14 alveolos 3 semillas de Zea mays y en otros 14 una cucharilla de café de semillas de Paspalum notatum y cubren con la mezcla y se riegan. Se dejan 7 alveolos en cada blíster con la mezcla como control. Los blíster se colocan en invernadero durante varios meses. Cada mes se hace una comprobación en seis alveolos de cada tipo de inóculo y cada planta y comprobar, densidad de raíces, micorrización esporulación y propágulos.

Seis de los alveolos son trasplantados a los dos meses debido al crecimiento a macetas de mayor tamaño.